L’emoglobinuria parossistica notturna (PNH) è un disturbo clonale delle cellule staminali ematopoietiche raro e potenzialmente letale, caratterizzato da emolisi intravascolare cronica causata dalla cascata complementare, trombosi e citopenie legate all’insufficienza midollare. Deriva da un’espansione mutazionale di un clone, che disattiva il gene PIG-A, situato sul cromosoma X, producendo una carenza di proteine legate a GPI (glicosilfosfatidilinositolo) sulla superficie di globuli rossi (RBC), monociti e granulociti. Queste includono due proteine regolatrici del complemento sulla membrana eritrocitaria, ovvero CD55 (fattore di accelerazione del decadimento – DAF) e CD59 (inibitore di membrana della lisi reattiva – MIRL). Una carenza di queste due proteine porta alla distruzione dei globuli rossi in vivo [1].

Diagnosi

La diagnosi di PNH prevede una serie di esami di laboratorio:

Citometria a flusso degli antigeni legati a GPI che mostra le popolazioni di globuli rossi e bianchi negative
Test di Coombs positivo
Anemia con aumento della conta reticolocitaria
Aumento della lattato deidrogenasi e della bilirubina
Diminuzione dell’aptoglobina
Emoglobina sierica libera ed emoglobinuria
Danno d’organo associato da emolisi e/o trombosi [1].

La citometria a flusso è considerata lo standard aureo per la rilevazione dei cloni PNH e svolge pertanto un ruolo importante nella diagnosi, nel monitoraggio e nella gestione clinica dei pazienti con PNH. Il più recente aggiornamento delle linee guida di consenso ICCS/ESCCA [riassunto in 2] garantisce una rilevazione sensibile e accurata anche dei cloni PNH minori.

Il DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit è stato sviluppato seguendo il più recente aggiornamento delle linee guida di consenso ICCS/ESCCA , che permette un elevato livello di sensibilità di rilevamento, in parte, grazie all’inclusione di FLAER (proaerolisina marcata con Alexa Fluor™ 488). FLAER si lega alle ancore GPI consentendo quindi di misurare la loro presenza o la loro assenza, indipendentemente da un particolare marcatore CD, su monociti e granulociti neutrofili.

Il kit fornisce due provette per paziente:

Provetta RBC, contenente CD71, CD59 e CD235a
Provetta WBC, contenente proaerolisina, CD157, CD45, CD64, CD24, CD14 e CD15

I cocktail per ogni provetta sono reagenti secchi, ovvero gli anticorpi vengono essiccati sulla superficie della provetta. Ciò consente un prolungamento della durata di conservazione e la conservazione e distribuzione a temperatura ambiente. I dettagli sulla preparazione dei campioni, sul gating e sull’interpretazione sono riportati nelle IFU.

CASO E RISULTATI

Una donna afroamericana di 19 anni si è presentata al pronto soccorso con tosse e urine scure; in precedenza era sana. L’anamnesi familiare mostrava che alla sorella era stato precedentemente diagnosticato il tratto falcemico.

Risultati ematologici

Un campione di sangue è stato inviato al laboratorio di ematologia, dove è stato eseguito un emocromo completo con un analizzatore della serie XN. I risultati (Fig. 1) mostravano che la paziente aveva un’anemia.

Rerun	Order	Run	Test	Result	C	Unit
	I	2	CBC Profile
	I	2	HGB	90		g/L
	I	2	WBC	2,56		10*9/L
	I	2	PLT	69	&	10*9/L
	I	2	RBC	2,48		10*1…
	I	2	HCT	0,277		L/L
	I	2	MCV	111,7		fL
	I	2	MCH	36,3		pg
	I	2	MCHC	325		g/L
	I	2	RDW-CV	19,9		%

			RET Profile
	R	2	RET#	70,7		10*9/L
	R	2	RET%	2,9		%
	R	2	RET-He	28,3		pg
	A	2	PLT-O	69		10*3/…

Fig. 1 Risultati del laboratorio di ematologia ottenuti con un analizzatore della serie XN

In sintesi, i parametri rilevanti per questo caso, con gli intervalli di riferimento interni all’ospedale indicati (tra parentesi), erano:

Emoglobina	90 g/L	(115 – 155 g/L)
Conta eritrocitaria	2,48 x 10¹²/L	(3,9 – 5,6 x 10¹²/L)
Ematocrito	0,277 L/L	(0,36 – 0,48 L/L)
Conta reticolocitaria	2,9%	(0,5 – 1,5%)

Risultati di altri test

Altri esami di laboratorio hanno confermato che l’anemia era di natura emolitica autoimmune:

Lattato deidrogenasi:	3170 U/L	(87 – 225 U/L)
Bilirubina totale:	1,9 mg/dL	(0 – 1,2 mg/dL)
Bilirubina indiretta:	1,6 mg/dL	(0,2 – 0,7 mg/dL)
Test di Coombs diretto positivo

Risultati dell’immunofenotipizzazione citometrica a flusso

La paziente è stata visitata da un ematologo, che ha inviato i campioni per i test per la PNH al laboratorio di citometria a flusso. È stata eseguita l’immunofenotipizzazione con il DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit. L’analisi dei dati ha mostrato un significativo clone PNH in RBC e WBC, mostrando chiaramente l’assenza di antigeni legati a GPI.

I risultati relativi agli eritrociti, con la provetta RBC, hanno rivelato il 76,75% di cloni di tipo III e il 2,54% di cloni di tipo II (Fig. 2).

Fig. 2 Immunofenotipizzazione con la provetta RBC del DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit, analizzata su XF-1600

I risultati relativi ai globuli bianchi con la provetta WBC hanno mostrato un clone di granulociti neutrofili tra il 95 e il 97% (Fig 3) e un clone di monociti del 98% (Fig 4).

Fig. 3 Immunofenotipizzazione con la provetta WBC del DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit, analizzata sull’XF-1600 e con gating sui granulociti neutrofili

Fig. 4 Immunofenotipizzazione con la provetta WBC del DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit, analizzata sull’XF-1600 e con gating sui monociti

Da queste informazioni l’ematologo ha potuto determinare che la paziente aveva sia la forma omozigote (tipo III) che quella eterozigote (tipo II) della PNH e le ha somministrato Eculizumab, un’immunoterapia che si lega alla proteina C5 del complemento e inibisce l’attivazione del sistema complementare [3]. Questo legame impedisce la disgregazione dei globuli rossi nel flusso sanguigno.

Negli ultimi sei mesi l’emoglobina e la conta dei globuli rossi della paziente si sono stabilizzate nel range di normalità e non si sono verificati altri episodi emolitici.

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

[1] Cançado RD et al. (2021): Consensus statement for diagnosis and treatment of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Hematol Transfus Cell Ther; 43(3):341-348. doi: 10.1016/j.htct.2020.06.006.

[2] Illingworth AJ, Marinov I, Sutherland DR (2019): Sensitive and accurate identification of PNH clones based on ICCS/ESCCA PNH Consensus Guidelines-A summary. Int J Lab Hematol; 41 Suppl 1:73–81. doi: 10.1111/ijlh.13011. PMID: 31069981.

[3] McKeage K (2011): Eculizumab. Drugs; 71:2327–2345. https://doi.org/10.2165/11208300-000000000-00000

Citofluorimetria clinica

Automazione accuratamente studiata per una miglior efficienza del flusso di lavoro

Per saperne di più

Calendario Scientifico 2025

Scopri già ora cosa ci riserva l’intero anno

Esplora i casi